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上海信帆生物:重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定

更新時(shí)間:2016-04-26      瀏覽次數(shù):1582

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)克隆工作中zui常用的雙酶切; 2、學(xué)習(xí)將外源基因與質(zhì)粒連接方法及操作技術(shù); 3、學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)細(xì)胞的技術(shù); 4、了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。 5、外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞的技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體的技術(shù)。 6、學(xué)習(xí)鑒定重組子的方法。 二、 實(shí)驗(yàn)原理 重組子的建立:采用雙酶切質(zhì)粒載體pBR322和pUC18,酶切后產(chǎn)生了互補(bǔ)的粘性末端,在T4 DNA 連接酶的作用下,兩個(gè)質(zhì)粒片段連接。 感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells):受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化,成為能容許多有外源DNA的載體分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞(competent cell) 。
??? 轉(zhuǎn)化(transformation):是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系,使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段,是基因工程(Genetic Engineering)等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 電轉(zhuǎn)化法:使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞,通過(guò)高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。 克隆的篩選:主要用不同抗生素(antibiotic)基因篩選。常用的抗生素(antibiotic)有:氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等; 重組質(zhì)粒克隆的鑒定:鑒定帶有重組質(zhì)??寺〉姆椒ǔS玫挠?alpha;-互補(bǔ)、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。zui常用的方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析,對(duì)于帶有LacZ基因的載體還可以結(jié)合α-互補(bǔ)現(xiàn)象來(lái)篩選。 三、試劑與器材 1、試劑 pUC18質(zhì)粒,pBR322質(zhì)粒,DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切緩沖液, EcoR I(15U/ul)及酶切緩沖液,DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa),LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ,LB固體培養(yǎng)基,50mg/ml卡那霉素(kanamycin)儲(chǔ)存液,質(zhì)粒快速提取試劑盒(博大泰克),10 X Buffer K, Pst I,EcoR I (TaKaRa) 2、器材 電基因轉(zhuǎn)移議,恒溫搖床,臺(tái)式高速離心機(jī),恒溫水浴鍋, 瓊脂糖凝膠電泳裝置,電熱恒溫培養(yǎng)箱,電泳儀,超凈工作臺(tái), 微量移液槍?zhuān)琫ppendorf管。 四、操作方法 1.構(gòu)建重組質(zhì)粒 質(zhì)粒pUC18和pBR322分別用Pst I和EcoR I雙酶切,將酶切產(chǎn)物按照1:1的比例混合,使用T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒。 2.制備感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli)細(xì)胞 收集大腸桿菌(Escherichia coli)細(xì)胞,采用CaCl2 處理,制備成感受態(tài)細(xì)胞。 3.重組子的轉(zhuǎn)化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒加入到制備的感受態(tài)細(xì)胞懸浮液中,電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。 4.重組子的篩選鑒定 采用藍(lán)白篩選重組子。酚/氯仿快速抽提質(zhì)粒,酶切后電泳鑒定。 ?五、關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng) 2.連接反應(yīng)溫度選擇要適中,過(guò)高粘末端之間形成氫鍵不穩(wěn)定,過(guò)低會(huì)影響連接酶的活性。 3.連接反應(yīng)兩種質(zhì)粒的比例為1:1,否則容易自連。 4.制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)要采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期的細(xì)胞,低溫處理時(shí)間要足夠。 5.電擊法時(shí)電擊電壓、電流、時(shí)間選擇要合適。 6.轉(zhuǎn)化及藍(lán)白篩選要作陰、陽(yáng)性對(duì)照,防止出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性。

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