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免疫組織可以走捷徑?IHC 優(yōu)化下貼士

更新時間:2016-01-14      瀏覽次數(shù):1390

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免疫組化(IHC)的原理是,根據(jù)抗體與抗原的特異結(jié)合來檢測組織切片中的抗原(如蛋白)。詞根immuno是指操作中所使用的抗體,而histo代表著組織。

利用特異的腫瘤標(biāo)志物,醫(yī)生們可以通過IHC診斷腫瘤是良性還是惡性,確定腫瘤的分期和分級,鑒別細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)移的來源。IHC也能用于藥物開發(fā),研究者們通過檢測靶點(diǎn)的上調(diào)或下調(diào)來判斷藥物的療效。

商業(yè)化的IHC抗體一般都提供有稀釋和染色的建議,能為你節(jié)省許多摸索過程。然而,事情往往沒那么簡單。你的抗體可能沒在IHC中驗(yàn)證過,或者你的樣本并不標(biāo)準(zhǔn),又或者實(shí)驗(yàn)就是不像文獻(xiàn)或演示視頻那樣順利,這時我們該怎么辦呢?

“IHC不只與一抗有關(guān),還有緩沖液、抗原修復(fù)液和酶,”紐約大學(xué)Langone醫(yī)學(xué)中心的IHC主管Luis Chiriboga說,“這些都是重要的變量。”平衡這些變量是一件相當(dāng)繁瑣事,而本文介紹的一些小竅門可以幫你簡化這一過程。

首先要有信號

Chiriboga在教學(xué)生做IHC時總會說,生成信號是*要務(wù)。“你必須先看到信號,才知道接下來要怎么做。” 一開始他通常使用較高的抗體濃度,在抗原表達(dá)水平不同的組織中進(jìn)行測試,以便獲得一個動態(tài)范圍。

不過,調(diào)整信號就不只是抗體的問題了。“高品質(zhì)抗體是*要素。但如果用錯了其它試劑,好抗體也會失敗,”CST公司的Katherine Crosby說。

緩沖系統(tǒng)對一抗結(jié)合抗原的能力有著深遠(yuǎn)的影響。如果你用了抗體供應(yīng)商推薦的試劑和方案但卻沒有看到理想的結(jié)果,就應(yīng)該及時供應(yīng)商的。如果你用的是經(jīng)未測試的抗體,就有必要對pH或離子強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)。

如果實(shí)驗(yàn)仍然檢測不到組織里的抗原,但該抗原的確有表達(dá),那么可能是抗原表位在固定過程中出了問題(比如被掩蓋或變性)。在這種情況下,我們就需要對抗原進(jìn)行修復(fù)。目前的抗原修復(fù)基本上是酶處理(比如pronase或trypsin)或者某種形式的加熱,Sigma Aldrich公司的Lynn Stephenson說。

另外,我們還可以嘗試不同的固定劑,用乙醇、甲醇甚至丙酮來取代福爾馬林。“這些試劑會使抗原表位產(chǎn)生不同的改變,”Stephenson指出。

更好的標(biāo)記體系

一般情況下,抗原識別只是整個過程的一部分。經(jīng)典IHC方案是用二抗來識別一抗。二抗可以與辣根過氧化物酶(HRP)直接相連,不過更多情況是先用二抗連接生物素,然后用連有酶的鏈霉親和素來進(jìn)行識別。這樣能形成一個多層次的信號放大系統(tǒng)。

“不過,這樣的系統(tǒng)也可能帶來更多的誤差和背景,”Sigma Aldrich公司的Aaron Sin說。舉例來說,親和素可能識別內(nèi)源生物素,尤其是在肝臟和腎臟這樣的組織。(延伸閱讀:攻克多重PCR之難)

為此,許多研究者放棄了偶聯(lián)生物素的二抗,開始使用一種以聚合物為基礎(chǔ)的試劑。“它們相當(dāng)于拖著一長串酶的二抗,”Vector Laboratories公司的Craig Pow說,該公司致力于生物試劑蛋白標(biāo)記和檢測試劑。“這顯然比使用HRP二抗要靈敏得多。”

據(jù)Pow介紹,這種試劑的敏感度與生物素/親和素差不多,但使用起來要簡單得多,而且不用擔(dān)心內(nèi)源生物素產(chǎn)生的背景。如果需要更高的敏感度,還可以采用基于多級聚合物的試劑,比如Vector Laboratorieszui近推出的ImmPRESS™ Excel Amplified HRP Polymer Staining Kit。

與酶體系相比,熒光體系能夠更的定位抗體,甚至可以同時成像兩個核抗原。不過,熒光成像的黑色背景不能提供常規(guī)顯微鏡那樣的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。Sigma Aldrich公司的Duolink®系統(tǒng)有足夠的敏感性和特異性,可以通過兩個一抗檢測鄰近的抗原表位。

選擇合適的顏色

IHC中zui常用的酶是HRP和堿性磷酸酶(AP),不過它們的效果并非*相同。HRP體系傾向于生成更密集的信號,“與AP相比能提供更細(xì)小更清晰的定位,”Pow說。但這并不是說AP就比HRP差,“實(shí)際上在某些應(yīng)用中,正因?yàn)锳P不那么稠密,反而能展現(xiàn)出更好的形態(tài)。”

這兩種酶都有不同的生色底物,可以產(chǎn)生不同顏色的產(chǎn)物。“我們應(yīng)當(dāng)選擇合適的顏色和復(fù)染劑,”Crosby說。

IHC遠(yuǎn)遠(yuǎn)不是把抗體放在組織切片上,然后用顯微鏡觀察那么簡單。要想得到實(shí)用、可靠而且清晰的結(jié)果,就需要耐心的對每一步進(jìn)行優(yōu)化。

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