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信帆生物為您提供-酶聯(lián)免疫吸附測定法技術(shù)原理分析

更新時間:2015-11-23      瀏覽次數(shù):1432

 基本原理

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時,把受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進行 定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,故可極大地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達到很高的敏感度。

ELISA 可用于測定抗原,也可用于測定抗體。在這種測定方法中有 3 種必要的試劑:

①固相的抗原或抗體

②酶標(biāo)記的抗原或抗體

③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件,可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。

注意事項

⒈正式試驗時,應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高,說明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA 等封閉。

⒉ 在 ELISA 中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:

⑴ 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。當(dāng)前常用的是 40孔聚苯乙烯 凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進行篩選:用等量抗原包被,在同一實驗條件下進行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

⑵ 包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求 PH 在 9.0~9.6之間。吸附溫度,時間及其蛋白量也 有一定影響,一般多采用 4℃18~24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0 和 10 μg/ml 等)進行包被后,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標(biāo)本的 OD 值。選擇 OD 值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為 1~10 μg/ml.

⑶ 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接 ELISA 法進行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取「方陣法」(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

⑷ 酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體(如 OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護。有條 件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如 TMB 和 ABTS是當(dāng)前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間, 以 10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是 H2O2 在臨用前加入。

 基本原理

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時,把受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進行 定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,故可極大地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達到很高的敏感度。

ELISA 可用于測定抗原,也可用于測定抗體。在這種測定方法中有 3 種必要的試劑:

①固相的抗原或抗體

②酶標(biāo)記的抗原或抗體

③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件,可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。

注意事項

⒈正式試驗時,應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高,說明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA 等封閉。

⒉ 在 ELISA 中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:

⑴ 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。當(dāng)前常用的是 40孔聚苯乙烯 凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進行篩選:用等量抗原包被,在同一實驗條件下進行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

⑵ 包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求 PH 在 9.0~9.6之間。吸附溫度,時間及其蛋白量也 有一定影響,一般多采用 4℃18~24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0 和 10 μg/ml 等)進行包被后,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標(biāo)本的 OD 值。選擇 OD 值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為 1~10 μg/ml.

⑶ 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接 ELISA 法進行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取「方陣法」(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

⑷ 酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體(如 OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護。有條 件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如 TMB 和 ABTS是當(dāng)前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間, 以 10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是 H2O2 在臨用前加入。 基本原理

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時,把受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進行 定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,故可極大地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達到很高的敏感度。

ELISA 可用于測定抗原,也可用于測定抗體。在這種測定方法中有 3 種必要的試劑:

①固相的抗原或抗體

②酶標(biāo)記的抗原或抗體

③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件,可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。

注意事項

⒈正式試驗時,應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高,說明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA 等封閉。

⒉ 在 ELISA 中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:

⑴ 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。當(dāng)前常用的是 40孔聚苯乙烯 凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進行篩選:用等量抗原包被,在同一實驗條件下進行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

⑵ 包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求 PH 在 9.0~9.6之間。吸附溫度,時間及其蛋白量也 有一定影響,一般多采用 4℃18~24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0 和 10 μg/ml 等)進行包被后,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標(biāo)本的 OD 值。選擇 OD 值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為 1~10 μg/ml.

⑶ 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接 ELISA 法進行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取「方陣法」(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

⑷ 酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體(如 OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護。有條 件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如 TMB 和 ABTS是當(dāng)前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間, 以 10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是 H2O2 在臨用前加入。
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