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T細(xì)胞亞群試劑盒如何使用,操作過(guò)程詳解

更新時(shí)間:2020-06-16      瀏覽次數(shù):2099

T細(xì)胞亞群試劑盒如何使用,操作過(guò)程詳解

上海信帆生物供應(yīng)T細(xì)胞亞群測(cè)試盒,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,庫(kù)存充足,深受廣大科研用戶青睞!

T細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

 

一:試劑盒組成:

1.

防脫片劑

2ml

2.

固定液

10ml

3.

A小鼠抗人CD3單抗

1ml

 

B小鼠抗人CD4單抗

1ml

 

C小鼠抗人CD8單抗

1ml

4.

生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG( IgG/Bio)

3ml

5.

堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素(S-A/AP)

3ml

6.

A底物增強(qiáng)劑(40×)

200μl

 

B底物液(40×)

200μl

 

C底物緩沖液(10×)

800μl

7.

細(xì)胞核復(fù)染液

5ml

8.

封片劑

1ml

9.

記號(hào)筆

1支

10.

PBS

2包(1000ml)

 

二:標(biāo)本制備:

 

取肝素抗凝(25μl/ml)的靜脈血1~2ml,PBS稀釋1-2倍后,沿裝有等量淋巴細(xì)胞分離液的試管壁混勻緩慢加至液面上層,保持兩種液體界面清晰,離心(2000轉(zhuǎn)/分)15-20分鐘,吸取兩液面交界處的單個(gè)核細(xì)胞層,加5倍PBS,離心(1000轉(zhuǎn)/分)5分鐘,棄上清液,沉淀即為單個(gè)核細(xì)胞。利用試管中剩余的少許回流液體(約一滴)混勻細(xì)胞,制成單個(gè)核細(xì)胞懸液。滴30μl細(xì)胞懸液于載玻片上,靜置2分鐘使細(xì)胞下沉粘附于玻片上,吸去液體,快速吹干或37℃溫箱1小時(shí)烤干。或用PBS將單個(gè)核細(xì)胞調(diào)至2×105個(gè)/ml,離心涂片機(jī)1000轉(zhuǎn)離心1-2分鐘制片,快速吹干或37℃溫箱1小時(shí)烤干。涂片前取防脫片劑5-10μl均勻推片,亦可用棉簽粘取防脫片劑均勻涂于干凈玻片上,待干后制備細(xì)胞涂片,以防掉片。

 

三:顯色劑的配制:

分別取A液25ul,B液25ul置于干凈試管中混勻,室溫放置2-5分鐘,加1ml蒸餾水,混勻,再加C液100ul待用。

*使用前,根據(jù)所需顯色劑用量,按照以上比例現(xiàn)配現(xiàn)用。

 

四:標(biāo)本染色:

1. 充分干燥(室溫2小時(shí)以上或過(guò)夜)的細(xì)胞涂片先用記號(hào)筆在標(biāo)本外畫(huà)圈,然后滴加固定液50μl,室溫靜置2-3分鐘,用PBS淋洗,擦干玻片背面及細(xì)胞外的PBS。

*以下反應(yīng)均需在濕盒中進(jìn)行。

2. 分別滴加抗人CD3、CD4、CD8單抗適量(10-30μl),4℃過(guò)夜,PBS淋洗3次。

3. 滴加生物素標(biāo)記抗小鼠IgG適量(10-30μl),37℃孵育30-45分鐘,PBS淋洗3次。

4. 滴加堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素適量(10-30μl)37℃孵育30-45分鐘,PBS淋洗3次。

5. 滴加顯色劑30-50μl,室溫顯色20-40分鐘??稍陲@微鏡下觀察,待細(xì)胞膜上出現(xiàn)紅色標(biāo)記物時(shí),用PBS淋洗。

6. 滴加細(xì)胞核復(fù)染液30-50μl,30秒后自來(lái)水淋洗。

7. 滴加封片劑,蓋片封片,鏡檢。如不需保存亦可用水替代封片劑蓋片鏡檢。

 

五:觀察:

 

高倍鏡下選取染色好的視野記數(shù)100-200個(gè)單個(gè)核細(xì)胞,細(xì)胞表面有紅色標(biāo)記物為陽(yáng)性細(xì)胞。算出陽(yáng)性率。

 

六:正常參考值:

 

正常人外周血中,陽(yáng)性細(xì)胞百分率一般在:CD3,60-80%;CD4,35-55%;CD8,20-30%;CD4/CD8的比值在1.5-2.0范圍內(nèi)。

 

七:儲(chǔ)存條件及有效期:

 

2-8℃保存,禁止冷凍,有效期為12個(gè)月。有效期內(nèi)可在0-25℃范圍內(nèi)七天短時(shí)運(yùn)輸。使用時(shí)應(yīng)及時(shí)及拿及用,使用后應(yīng)立即放回冰箱。生物試劑日期,使用期限或失效日期見(jiàn)標(biāo)簽。

 

八:注意事項(xiàng):

 

1. 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)是一種包含多步驟的檢測(cè)方法,試劑的選擇、樣本的處理、涂片的制備、染色及其結(jié)果的判讀均需要進(jìn)行專業(yè)的培訓(xùn)。

2. 任何陽(yáng)性或陰性的解讀,應(yīng)由病理科醫(yī)生結(jié)合病理形態(tài)學(xué),研究表現(xiàn)及其它檢測(cè)方法進(jìn)行,不作為單獨(dú)的診斷指標(biāo)。

3. 復(fù)染過(guò)度或不足都可能影響結(jié)果的判讀。

4. 陰性結(jié)果表示未檢出抗原,不一定表示樣本中無(wú)該抗原存在,待測(cè)抗原編碼基因變異,抗原低表達(dá)或抗原修復(fù)不當(dāng)?shù)?,都?huì)造成抗原無(wú)法檢出。

5. 本試劑僅對(duì)經(jīng)處理的人外周血細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證,不做其他用途

6. 試劑盒使用中,應(yīng)有適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施,以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。

 

T細(xì)胞亞群試劑盒如何使用,操作過(guò)程詳解

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