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信帆生物:常用的免疫組化染色方法

更新時間:2016-12-27      瀏覽次數(shù):1900

(一)、ABC法:(注,下面各種方法,均為手工操作,如沒特別說明,均在室溫下進行)

1.切片經(jīng)二甲苯Ⅰ 5分鐘。

2.切片經(jīng)二甲苯Ⅱ 5分鐘。

3. *Ⅰ 30秒。

4. *Ⅱ 30秒。

5. 95%酒精Ⅰ 30秒。

6. 95%酒精Ⅱ 30秒。

7. 90%酒精 30秒。

8.80%酒精 30秒。

9. 70%酒精 30秒。

10.自來水洗。(后面的切片脫蠟至水一般都是1-10)

11.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鐘。

12.水洗。

13.抗原修復(fù)。

14.PBS洗3次,1分鐘/次。

15.加入血清孵育20分鐘。

16.摔干血清,加入一抗60分鐘。

17.PBS洗3次,2分鐘/次。

18.加入二抗孵育30分鐘。

19.PBS洗3次,2分鐘/次。

20.加入ABC復(fù)合物,孵育30分鐘。

21. PBS洗3次,2分鐘/次。

22.DAB-H2O2孵育切片5-10分鐘。

23.PBS洗,水洗。

24.Harris蘇木素染核5-10分鐘。

25.水洗,分化,藍化,脫水,透明并封固。

(二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln)

1.切片脫蠟至水。

2.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鐘。

3.水洗。

4.抗原修復(fù)。

5.PBS洗3次,1分鐘/次。

6.加入血清孵育10分鐘。

7.摔去血清,加入一抗孵育30-60分鐘。

8.PBS洗3次,每次2分鐘。加入二抗,孵育20分鐘。

9.PBS洗3次,每次2分鐘。

10.加入SP復(fù)合物孵育20-30分鐘。

11.PBS洗3次,每次2分鐘。

12.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。

13.PBS洗,水洗。

14.Harris蘇木素染核5-10分鐘。

15.水洗,分化 ,藍化,脫水,透明并封固。

(三)真空負壓LSAB法

1.切片脫蠟至水。

2. 0.3%H2O2甲醇真空負壓處理5min.

3. 水洗。

4.如果需要,可進行抗原修復(fù)。

5.PBS洗3次,每次1分鐘。

6.加入正常血清真空負壓處理5min。

7.摔干血清,加入*抗體,真空負壓處理5分鐘。

8. PBS洗3次,每次2分鐘。

9. 加入二抗(即連接抗體)真空負壓處理5分鐘。

10.PBS洗3次,每次2分鐘。

11.加入鏈卵蛋白復(fù)合物,真空負壓處理 5分鐘。

12.PBS洗3次,每次2分鐘。

13.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。

14.PBS洗,水洗。

15.染核,分化,藍化,脫水,透明并封固。

注:真空負壓即將真空干燥中抽成真空。負壓達66.7KPa(500mmHg)

(四)Envision TM Systems.

1.切片脫蠟至水。

2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

3.水洗。

4.抗原修復(fù)。

5.PBS洗3次,每次1分鐘。

6.加入一抗體孵育30-60分鐘。

7.PBS洗3次,每次2分鐘。

8.加入增強劑孵育20-30分鐘。

9.PBS洗3次,每次2分鐘。

10.加入酶標抗兔/鼠,復(fù)合物,孵育20-30分鐘。

11.PBS洗3次,每次2分鐘。

12.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。

13.PBS洗,水洗。

14.Harris蘇木素染核5-10分鐘。

15.水洗,分化,藍化,脫水,透明并封固。

(五)免疫組化雙染色法。(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)

1.切片脫蠟至水。

2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

3.水洗。

4.抗原修復(fù)。

5.PBS洗3次,每次1分鐘。

6.加入非免疫性動物血清,孵育10分鐘。

7.PBS洗3次,每次2分鐘。

8.加入*抗體孵育60分鐘。

9.PBS洗3次,每次2分鐘。

10.加入生物素化的第二抗體,孵育10分鐘。

11.PBS洗3次,每次2分鐘。

12.加入鏈卵蛋白素過氧化物酶孵育10分鐘。

13.PBS洗3次,每次2分鐘。

14.加入DAB-H2O2孵育5-10分鐘。

15.PBS洗3次,每次2分鐘。

16. 加入雙染增強液,孵育10分鐘。

17. 加入非免疫性動物血清孵育10分鐘。

18. PBS洗3次,每次2分鐘。

19. 加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。

20. PBS洗3次,每次2分鐘。

21. 加入生物素標記的第二抗體孵育10分鐘。

22. PBS洗3次,每次2 分鐘。

23. 加入鏈卵蛋白素堿性磷酸酶孵育10分鐘。

24. PBS洗3次,每次2分鐘。

25. 加入AEC溶液,孵育5-10分鐘。

26. 自來水洗。

27. 蘇木素染核5-10分鐘。

28. 水性封片。

注:1.*種復(fù)合物也可先用鏈卵蛋白素堿性磷酸酶。

2.第1次顯色也可用BCIP/NBT溶液,顏色為藍黑色,但應(yīng)與蘇木素鑒別。

(六)、免疫組化的雙染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method)

1.切片脫蠟至水。

2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

3.水洗。

4.抗原修復(fù)。

5.PBS洗3次,每次1分鐘。

6.加入選用的*抗體孵育30-60分鐘。

7.PBS洗3次,每次2分鐘。

8.加入增強劑孵育20-30分鐘。

9.PBS洗3次,每次2分鐘。

10.加入酶標抗兔/鼠,復(fù)合物,孵育

11.PBS洗3次,每次2分鐘。

12.加入DAB-H2O2孵育5-10分鐘

13.PBS洗3次,每次2分鐘。

14.加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。

15.PBS洗3次,每次2分鐘。

16. 加入增強劑孵育20-30分鐘。

17. PBS洗3次,每次2分鐘。

18. 加入酶標抗兔/鼠堿性磷酸酶復(fù)合物孵育20-30分鐘。

19.PBS洗3次,每次2分鐘。

20.加入AEC溶液孵育5-10分鐘。

21.自來水洗。

22.蘇木素染核5-10分鐘。

23.水性封片。

(七)細胞培養(yǎng)片免疫熒光染色法。

1.將細胞于載片或蓋玻片的片子用生理鹽水洗幾次。

2.純丙酮固定10分鐘。

3.PBS浸洗3次,每次1分鐘。

4.加入選用的*抗體孵育120分鐘。

5.PBS洗3次,每次2分鐘。

6.加入熒光抗體孵育60分鐘以上。

7.PBS法3次,每次2分鐘。

8.0.1%伊文氏藍襯染3分鐘。

9.水洗,蒸餾水洗。

10. 水性膠封片或用緩沖甘油封片。

(八)真空負壓免疫熒光染色法染細胞培養(yǎng)片。

1. 將細胞爬于載玻片或蓋玻片的片子用生理鹽水浸洗數(shù)次,*洗去蛋白液。

2.純丙酮固定5-10分鐘。

3.PBS浸洗3次,每次1分鐘。

4.加入選用的*抗體孵育真空負壓處理15分鐘。

5.PBS洗3次,每次2分鐘。

6.加入熒光抗體孵育真空負壓處理15分鐘。

7.PBS洗3次,每次2分鐘。

8.0.1%伊文氏藍襯染3分鐘。

9.水洗,蒸餾水洗。

10.水性膠封片或用緩沖甘油封片。

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